Проектирана „мини“ система за редактиране на гени CRISPR – по -лесна за доставка до човешки клетки за генна терапия

Биоинженерите са използвали повторно „неработещата“ система CRISPR, за да направят по-малка версия на инструмента за геномно инженерство. Неговият малък размер трябва да улесни достъпа до клетки, тъкани и човешкото тяло за генна терапия.

Обща аналогия за редактирането на гени CRISPR е, че той работи като молекулярни ножици, изрязвайки специфични секции от ДНК. Стенли Ки, асистент по биоинженеринг в Станфордския университет, харесва тази аналогия, но смята, че е време да преосмислим CRISPR като нож на швейцарската армия.

„Технологията CRISPR може да бъде проста като тример или по -напреднала, като регулатор, редактор, етикет или изображение“, казва Ци, който също е асистент по химия и системна биология в Медицинския факултет на Станфордския университет и изследовател в Stanford ChEM-H. „Много приложения се появяват от тази вълнуваща област.“

Въпреки това, много от различните CRISPR системи, използвани или клинично тествани за генна терапия за заболявания на окото, черния дроб и мозъка, остават ограничени по обхват, тъй като всички те страдат от един и същ дефект: те са твърде големи и следователно трудно се прехвърлят в клетки, тъкани или организми.

В доклад, публикуван на 3 септември в молекулна клеткаЦи и неговите сътрудници обявиха това, което смятат за огромна крачка напред за CRISPR: мини CRISPR система. Като има предвид, че често използваните CRISPR системи-с имена като Cas9 и Cas12a, обозначаващи различни версии на свързаните с CRISPR Cas протеини-се състоят от около 1000 до 1500 Аминокиселини, „CasMINI“ има 529.

В своите експерименти изследователите потвърдиха, че CasMINI може да изтрие, активира и модифицира генетичния код, точно както неговите по -големи колеги. По -малкият му размер означава, че трябва да бъде по -лесно да се доставя до човешките клетки и човешкото тяло, което го прави потенциален инструмент за лечение на различни заболявания, включително очни заболявания, дегенерация на органи и генетични заболявания като цяло.

постоянни усилия

За да направят системата възможно най -малка, изследователите решават да започнат с CRISPR протеина Cas12f (известен също като Cas14), тъй като той съдържа само около 400 до 700 аминокиселини. Въпреки това, подобно на други CRISPR протеини, Cas12f естествено произхожда от Archaea – едноклетъчни организми – което означава, че е напълно неподходящ за клетки на бозайници, да не говорим за човешки клетки или тела. Известно е, че няколко CRISPR протеина функционират в клетки на бозайници без модификация. За съжаление, CAS12f не е един от тях. Това го прави привлекателно предизвикателство за биоинженери като Ци.

„Мислехме си:„ Е, милиони години еволюция не са успели да превърнат тази система CRISPR в нещо, което работи в човешкото тяло. Можем ли да променим това само за година или две? „Доколкото ми е известно, за първи път сме превърнали нефункциониращ CRISPR в работещ.“

Всъщност Xiaoshu Xu, постдокторант в лабораторията Qi и водещ автор на статията, не вижда активност за нормален Cas12f в човешките клетки. Xu и Qi предположиха, че проблемът е, че ДНК на човешкия геном е по -сложна и по -малко достъпна от микробната ДНК, което затруднява Cas12f да намери своята цел в клетките. Като се вземе предвид изчислително очакваната структура на системата Cas12f, тя внимателно подбра около 40 протеинови мутации, които биха могли да заобиколят това ограничение и установи конвейер за тестване на много протеинови варианти едновременно. Работният вариант на теория би превърнал човешка клетка в зелено чрез активиране на зелен флуоресцентен протеин (GFP) в нейния геном.

„В началото тази система изобщо не работеше една година“, каза Шоу. „Но след биоинженерните итерации видяхме, че някои от инженерните протеини започват да действат, като магия. Това наистина ни накара да оценим силата на синтетичната биология и биоинженерството.“

Първите успешни резултати бяха скромни, но те развълнуваха Сю и я насърчиха да продължи, защото това означаваше, че системата работи. В продължение на много допълнителни повторения успях да подобря работата на протеина. „Започнахме, като видяхме само две клетки, показващи зелен сигнал, а сега след инженерството почти всяка клетка е зелена под микроскопа“, каза Сю.

„В един момент трябваше да го спра“, спомня си Че. „Казах:“ Сега е добре. Направихте добра система. Трябва да помислим как можем да използваме тази молекула в приложения. „

В допълнение към проектирането на протеина, изследователите също са проектирали РНК който насочва протеина Cas към целевата ДНК. Необходими са модификации и на двата компонента, за да може системата CasMINI да функционира в човешки клетки. Те тестваха способността на CasMINI да изтрива и редактира гени в лабораторно зависими човешки клетки, включително гени, свързани с HIV инфекция, антитуморен имунен отговор и анемия. Той работи върху почти всеки ген, който тества, със силни реакции в много от гените.

отваряне на вратата

Изследователите вече започват да обединяват сътрудничество с други учени за преследване на генни терапии. Те също се интересуват от това как това може да допринесе за напредъка в РНК технологиите – например какво е използвано за разработване на иРНК COVID-19 Ваксини – където размерът също може да бъде ограничаващ фактор.

„Тази способност за проектиране на тези системи се изисква в полето от първите дни на CRISPR и аз чувствам, че сме направили нашата част, за да преминем към тази реалност“, каза Ци. Този инженерен подход може да бъде много полезен. Това ме вълнува – отваря вратата към нови възможности. „

Справка: „Инженерната миниатюрна система CRISPR-Cas за регулиране и редактиране на геноми на бозайници“ От Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, Leiping Zeng, Hannah R. Kempton, Stephen Shang, Muneaki Nakamura и Lei S. Qi, 3 септември 2021 г., молекулна клетка.
doi: 10.1016/j.molcel.2021.08.008

Допълнителни съавтори на Станфордския университет за доклада са аспирантите Августин Чимбарати и Хана Кемптън, и докторантите Липинг Женг, Стивън Чанг и Муняки Накамура. Qi също е член на Stanford Bio-X. Институтът за изследване на здравето на майката и детето (MCHRI), Станфордският раков институт и Институтът по неврология Wu Tsai. Това изследване е финансирано от фондация Li Ka Shing.